Czy zdarzyło Ci się niepowodzenie w tak podstawowej metodzie laboratoryjnej, jaką jest transformacja bakterii obcym DNA? Ta względnie mało skomplikowana metoda potrafi czasem być na tyle kapryśna, by spędzić nam sen z powiek. Wystarczy użyć „starych” lub nie do końca kompetentnych bakterii lub zastosować zbyt wysokie ilości DNA, aby na drugi dzień zamiast pięknych kolonii zobaczyć czyste szalki. Zaoszczędź sobie tej frustracji i użyj sprawdzonego przepisu, który przedstawiam poniżej:
1. Przygotowanie chemicznie kompetentnych E. coli
(przed rozpoczęciem procedury przygotuj około 25 ml sterylnego 50 mM CaCl2 i schłódź go w lodówce)
zaszczep 1 ml pożywki (LB lub BHI) odpowiednim szczepem E.coli (np. DH5α, TOP10)
hoduj przez noc w 37 st. z wytrząsaniem (~ 16 h)
zaszczep 40 ml pożywki 1 ml kultury nocnej i hoduj w 37 st. z wytrząsaniem (sprawdzaj regularnie OD600)
gdy OD600 = 0,2 – 0,25 zakończ hodowlę i przetrzymaj bakterie na lodzie przez 15 min
zwiruj hodowlę (5 000 rpm, 10 min, 4 st.)
rozpuść pelet bakteryjny w 20 ml zimnego CaCl2 (50 mM)
inkubuj 20 min na lodzie
zwiruj hodowlę (5 000 rpm, 10 min, 4 st.)
rozpuść pelet bakteryjny w 1 ml zimnego CaCl2 (50 mM)
inkubuj około 30-40 min na lodzie
po tym czasie bakterie są gotowe do użycia
Uwaga! Bakterie pozostaną kompetentne przez następne 2-3 dni jeśli przechowasz je w lodówce (nie dłużej!) Możesz również przechować je przez dłuższy czas (2-3 miesiące) w -80 st.
2. Transformacja bakterii kompetentnych metodą „heat shock”
przygotuj porcję chemicznie kompetentnych bakterii (50-100 µl)
zmieszaj bakterie z wektorem, który chcesz wprowadzić – użyj około 10-30 ng plazmidowego DNA zawieszonego w wodzie
inkubuj 30-45 min na lodzie
przełóż próbkę na 90 sek do 42 st. („heat shock”)
przełóż bakterie z powrotem na lód (5 min)
dodaj 250 µl pożywki (LB, BHI lub SOC) – możesz ją wcześniej ogrzać do 37 st.
hoduj przez 30-40 min w 37 st. z wytrząsaniem
posiej około 100 µl zawiesiny na płytki selekcyjne
hoduj przez noc w 37 st. (lub przez weekend w temperaturze pokojowej, jeśli doświadczenie wypadło na piątek..)
— uważaj, żeby nie doprowadzić do przerośniecia kolonii, gdyż w takim wypadku poszczególne klony mogą zrosnąć się ze sobą!
— wyrosłe kolonie powinny posiadać obce DNA; możesz sprawdzić to metodami Colony PCR, czy Rapid Colony Screening lub wyizolować plazmid z pojedynczej hodowli (po jej uprzednim rozhodowaniu) i zsekwencjonować.
Uwaga! Pamiętaj, aby posiać również kontrolę negatywną (bakterie nietransformowane), dzięki której sprawdzisz, czy antybiotyk w podłożu nie uległ rozkładowi.
Pamiętaj również, że podłoża stałe z antybiotykiem pomimo tego, że przechowywane są w lodówce nie nadają się do użycia po kilku miesiącach, gdyż antybiotyk ulega rozkładowi. Jeśli w Twoich bakteriach nie ma wprowadzonego DNA (pomimo obecnych transformantów) może być to wina „starych” szalek.
AM
Przeczytaj również
Gravity flow – krok naprzód …
Grawitację odczuwamy na co dzień. Jest ona zjawiskiem tak oczywistym … Przeczytaj całość
Wyniki fałszywie pozytywne w PCR! …
„Kontaminacja” to chyba najbardziej przerażające wyrażenie w słowniku każdego biologa … Przeczytaj całość
Labowe „know-how” — bakterie kompetentne i transformacja plazmidowym DNA
Source: Aktualności
Dodaj komentarz