Epigenetyka - Portal naukowy

Portal naukowy na temat dziedziny badawczej jaką jest epigenetyka. Badanie dziedziczności pozagenowej i ciekawe artykuły na temat epigenetyki oraz zdrowia człowieka.

  • Definicja
  • Epigenetyka
  • Nauka
  • Zdrowie
  • Genetyka
  • Aktualności
You are here: Home / Aktualności / Labowe „know-how” — bakterie kompetentne i transformacja plazmidowym DNA

Labowe „know-how” — bakterie kompetentne i transformacja plazmidowym DNA

Czy zdarzyło Ci się niepowodzenie w tak podstawowej metodzie laboratoryjnej, jaką jest transformacja bakterii obcym DNA? Ta względnie mało skomplikowana metoda potrafi czasem być na tyle kapryśna, by spędzić nam sen z powiek. Wystarczy użyć „starych” lub nie do końca kompetentnych bakterii lub zastosować zbyt wysokie ilości DNA, aby na drugi dzień zamiast pięknych kolonii zobaczyć czyste szalki. Zaoszczędź sobie tej frustracji i użyj sprawdzonego przepisu, który przedstawiam poniżej:
 
 

1. Przygotowanie chemicznie kompetentnych E. coli

 
(przed rozpoczęciem procedury przygotuj około 25 ml  sterylnego 50 mM CaCl2 i schłódź go w lodówce)
 

zaszczep 1 ml pożywki (LB lub BHI) odpowiednim szczepem E.coli (np. DH5α, TOP10)
hoduj przez noc w 37 st. z wytrząsaniem (~ 16 h)
zaszczep 40 ml pożywki 1 ml kultury nocnej i hoduj w 37 st. z wytrząsaniem (sprawdzaj regularnie OD600)
gdy OD600 = 0,2 – 0,25 zakończ hodowlę i przetrzymaj bakterie na lodzie przez 15 min
zwiruj hodowlę (5 000 rpm, 10 min, 4 st.)
rozpuść pelet bakteryjny w 20 ml zimnego CaCl2 (50 mM)
inkubuj 20 min na lodzie
zwiruj hodowlę (5 000 rpm, 10 min, 4 st.)
rozpuść pelet bakteryjny w 1 ml zimnego CaCl2 (50 mM)
inkubuj około 30-40 min na lodzie
po tym czasie bakterie są gotowe do użycia

Uwaga! Bakterie pozostaną kompetentne przez następne 2-3 dni jeśli przechowasz je w lodówce (nie dłużej!) Możesz również przechować je przez dłuższy czas (2-3 miesiące) w -80 st.
 

2. Transformacja bakterii kompetentnych metodą „heat shock”

 

przygotuj porcję chemicznie kompetentnych bakterii (50-100 µl)
zmieszaj bakterie z wektorem, który chcesz wprowadzić – użyj około 10-30 ng plazmidowego DNA zawieszonego w wodzie
inkubuj 30-45 min na lodzie
przełóż próbkę na 90 sek do 42 st. („heat shock”)
przełóż bakterie z powrotem na lód (5 min)
dodaj 250 µl pożywki (LB, BHI lub SOC) – możesz ją wcześniej ogrzać do 37 st.
hoduj przez 30-40 min w 37 st. z wytrząsaniem
posiej około 100 µl zawiesiny na płytki selekcyjne
hoduj przez noc w 37 st. (lub przez weekend w temperaturze pokojowej, jeśli doświadczenie wypadło na piątek..)

— uważaj, żeby nie doprowadzić do przerośniecia kolonii, gdyż w takim wypadku poszczególne klony mogą zrosnąć się ze sobą!

— wyrosłe kolonie powinny posiadać obce DNA; możesz sprawdzić to metodami Colony PCR, czy Rapid Colony Screening lub wyizolować plazmid z pojedynczej hodowli (po jej uprzednim rozhodowaniu) i zsekwencjonować.

Uwaga! Pamiętaj, aby posiać również kontrolę negatywną (bakterie nietransformowane), dzięki której sprawdzisz, czy antybiotyk w podłożu nie uległ rozkładowi.
Pamiętaj również, że podłoża stałe z antybiotykiem pomimo tego, że przechowywane są w lodówce nie nadają się do użycia po kilku miesiącach, gdyż antybiotyk ulega rozkładowi. Jeśli w Twoich bakteriach nie ma wprowadzonego DNA (pomimo obecnych transformantów) może być to wina „starych” szalek.
AM

Przeczytaj również

Gravity flow – krok naprzód …
Grawitację odczuwamy na co dzień. Jest ona zjawiskiem tak oczywistym … Przeczytaj całość


Wyniki fałszywie pozytywne w PCR! …
„Kontaminacja” to chyba najbardziej przerażające wyrażenie w słowniku każdego biologa … Przeczytaj całość


Labowe „know-how” — bakterie kompetentne i transformacja plazmidowym DNA
Source: Aktualności

Dodaj komentarz Anuluj pisanie odpowiedzi

Twój adres email nie zostanie opublikowany. Pola, których wypełnienie jest wymagane, są oznaczone symbolem *

Co to jest epigenetyka?

Klonowanie

Reprogramowanie epigenetyczne

Transkrypcja

Translacja

Tagi

biotechnologia choroby nowotworowe DNA epigenetyka gen. genetyka genomika geny klonowanie materiał genetyczny RNA zaburzenia DNA

Polecane strony

Sciencedirect Nature National Geographic

Archiwa

  • Luty 2019
  • Styczeń 2019
  • Październik 2018
  • Październik 2017
  • Wrzesień 2017
  • Kwiecień 2017
  • Marzec 2017
  • Luty 2017
  • Styczeń 2017
  • Grudzień 2016
  • Listopad 2016
  • Październik 2016
  • Sierpień 2016
  • Lipiec 2016
  • Czerwiec 2016
  • Kwiecień 2016

Portal Epigenetyka.pl

Serwis poświęcony tematyce epigenetyki i genetyki. Zbiór artykułów, ciekawostek i nowości z dziedziny eipigenetyki.

  • Kontakt

Najnowsze artykuły

  • Easy speaker – ceneo – forum – jak korzystać – Polska – allegro – aktywność
  • Smart lang – aktywność – efekty – forum – recenzja – Opinie – Polska
  • LashParade – Opinie – aktywność – efekty – Cena – allegro – jak korzystać
  • Nulante anti aging cream – ceneo – recenzja – Polska – allegro – skład – efekty
  • MultiSlim – sklep – Allegro – producent – krem – gdzie kupić – Apteka

Tagi

biotechnologia choroby nowotworowe DNA epigenetyka gen. genetyka genomika geny klonowanie materiał genetyczny RNA zaburzenia DNA
WSZELKIE PRAWA ZASTRZEŻONE © 2016 ·EPIGENETYKA.PL
Serwis wykorzystuje pliki cookies. Korzystając ze strony wyrażasz zgodę na wykorzystywanie plików cookies. dowiedz się więcej.